Matthias Schweighöfer ist der Sohn der Schauspieler Michael und Gitta Schweighöfer. Er bekam durch seine Eltern frühzeitig Kontakt zur Bühne und machte seine erste Bühnenerfahrung in einer Schulaufführung von Bertolt Brechts Dreigroschenoper, in der Matthias die Rolle des Mackie Messer verkörperte. Im Anschluss an sein Abitur am Chemnitzer Dr.-Wilhelm-André-Gymnasium begann er ein Studium an der Hochschule für Schauspielkunst „Ernst Busch" Berlin, brach es aber nach einem Jahr ab.
Als Matthias fünf Jahre alt war, trennten sich seine Eltern. Zunächst zog er mit seiner Mutter nach Frankfurt (Oder), später nach Chemnitz. Zu seinem in Berlin lebenden Vater hielt er parallel Kontakt und teilte sich bis 2010 eine kleine Wohnung mit ihm im Berliner Ortsteil Mitte.
Matthias Schweighöfer war von 2004 bis 2018 mit Unterbrechung mit der Regieassistentin Angelika Ani Schromm liiert, mit der er Anfang 2009 in einen Vierseithof in Brandenburg zog. Sie haben eine gemeinsame Tochter (* 2009) und einen gemeinsamen Sohn (* 2014). ). Im Januar 2019 gab Matthias die Trennung bekannt. Kurz darauf wurde bekannt, dass Matthias mit der Schauspielerin Ruby O. Fee liiert ist.
Im Jahr 1997 stand er im Alter von 16 Jahren unter der Regie von Andreas Dresen für den Fernsehfilm Raus aus der Haut zum ersten Mal vor der Kamera. Bis 1999 folgten weitere Rollen in deutschen Fernsehproduktionen, beispielsweise in Spuk aus der Gruft (1997), in der Episode Die Macht der Gedanken (1998) aus der RTL-Arztserie Dr. Stefan Frank – Der Arzt, dem die Frauen vertrauen, 1999 in der Auftaktepisode Der neue Mann, in der 16. Folge Leonardos Geheimnis der ZDF-Krimiserie Siska sowie in Spuk im Reich der Schatten (1999).
Ab 2000 wirkte Matthias Schweighöfer in weiteren Film- und Fernsehproduktionen. In dem Fernsehfilm Verbotenes Verlangen – Ich liebe meinen Schüler (2000) von Zoltan Spirandelli stellt er den Schüler Ben dar, der auf ein Verhältnis mit seiner Lehrerin eingeht. Für diese Darstellung erhielt er 2001 den Deutschen Fernsehpreis als bester Nachwuchsdarsteller. In der mit dem Erich Kästner-Fernsehpreis ausgezeichneten TV-Filmkomödie Küss mich, Frosch, die sich an das Märchen Der Froschkönig oder der eiserne Heinrich der Gebrüder Grimm anlehnt, verkörperte er den Prinzen Dietbert von Tümpelberg, der im Jahr 2000 von der Schülerin Anna Sandmann nach 1000 Jahren wieder ins Leben geküsst wird. Im Folgejahr war in zwei TV-Krimifilmen zu sehen. So in Polizeiruf 110: Zerstörte Träume in der Rolle des Sängers Daniel Cross, der in seinem Vorbereitungsraum mit einem leblosen Drogendealer und einem Obstmesser gesehen und danach bei der Polizei gemeldet wird. Schmücke, der mit seinem Kollegen Schneider ermittelt, ist Daniels Onkel. Im Ludwigshafener Tatort: Gewaltfieber sah man ihn in der Rolle des Jugendlichen Jacky Bräutigam.
Nach wiederholten Fernsehauftritten gab er 2001 sein Debüt auf der Kinoleinwand in dem Jugendfilm Herz im Kopf als Dirk. 2002 war Matthias neben Henriette Confurius als Holger in Anne Wilds Kurzfilm Ballett ist ausgefallen zu sehen. Zudem folgten in demselben Jahr weitere Kinorollen. William Malones Horrorfilm FearDotCom, in dem er die Rolle des Dieter Schrader verkörperte, war seine erste Filmrolle in den USA. Der endgültige Durchbruch gelang ihm 2003 an der Seite von Nora Tschirner in der Romanverfilmung Soloalbum, die ihm den New Faces Award einbrachte. Matthias arbeitete seitdem in zahlreichen nationalen und internationalen Produktionen sowie an renommierten deutschen Theaterhäusern.
Matthias spielte 2004 am Hebbel-Theater in dem Stück Eins, Zwei, Drei von Ferenc Molnár die Rolle des Kommunisten Piffl unter der Regie von Johannes Grebert und Matthias Matschke.
In Hendrik Hölzemanns Liebes-Drama Kammerflimmern spielte er neben Jessica Schwarz die Hauptrolle des Paul 'Crash' Partenheimer, der in jungen Jahren sowohl einen Tumor an der rechten Wange überlebt hat als auch einen Autounfall, bei dem seine Eltern ums Leben gekommen sind (2004; Auszeichnung: Bayerischer Filmpreis, DIVA-Award). In dem Künstlerdrama Baal, das auf dem im Dezember 1923 uraufgeführten Stück Bertolt Brechts basiert, agierte er neben Pasquale Aleardi in der Titelrolle (2004; Auszeichnung: Fernsehfilmfestival Baden-Baden). In der Kriminalkomödie Polly Blue Eyes spielte er den Ronald Ronny Helske, den neuen Freund von Pollys Schwester, dargestellt von Maxi Warwel (2005; Auszeichnung: DIVA-Award). In Schiller (2005) war Matthias Schweighöfer in der Titelrolle zu sehen. Für seine dort erbrachte schauspielerische Leistung wurde er bei der Undine Award-Verleihung als Bester jugendlicher Schauspieler in einem Fernsehfilm ausgezeichnet und erhielt darüber hinaus den DIVA-Award. An der Seite von Natalia Avelon, die in der Rolle der Uschi Obermaier zu sehen war, stellte Matthias in Das wilde Leben Obermaiers Beziehungspartner Rainer Langhans dar (2007; Auszeichnung: Undine Award).
Wiederholt arbeitet Matthias mit dem Schauspieler, Regisseur und Produzenten Til Schweiger zusammen. In den Liebeskomödien Keinohrhasen (2007) und Zweiohrküken (2009) war er in der Rolle des Moritz zu sehen. 2013 spielte er in Kokowääh 2 sich selbst.
In der Autobiographie Mein Leben – Marcel Reich-Ranicki übernahm er die Titelrolle des damals jungen Literaturkritikers Marcel Reich-Ranicki (2009; Auszeichnung: Goldene Kamera). Für die Rolle im Tatort: Weil sie böse sind des Balthasar Staupen, dessen Vater vom alleinerziehenden Vater eines autistischen Kindes mit einem Morgenstern erschlagen wird, wurde Matthias mit dem Hessischen Fernsehpreis ausgezeichnet. In der deutsch-englischen Produktion Friendship! (2010) von Markus Goller sah man ihn an der Seite von Friedrich Mücke als Tom, der mit seinen besten Freund Veit, den er aus Schulzeiten kennt, nach dem Mauerfall der DDR nach San Francisco zur Golden Gate Bridge will. In diesem Film sind Matthias' Filmeltern auch seine leiblichen Eltern.
Matthias gab 2010 sein Debüt als Regisseur mit der romantischen Komödie What a Man, bei der er zugleich als Hauptdarsteller und Koautor sowie über seine von ihm gegründete Produktionsgesellschaft Pantaleon Films als Koproduzent tätig war. Im August 2011 startete der Film in den deutschen Kinos, wo er rund 1,8 Millionen Besucher erreichte. Am 10. Januar 2013 kam sein zweiter Spielfilm Schlussmacher ins Kino, erneut von Pantaleon Films sowie 20th Century Fox realisiert und mit Matthias als Regisseur und Hauptdarsteller. Für diesen Film erhielt er zusammen mit Marco Beckmann, Dan Maag und Cornel Schäfer einen Romy in der Kategorie Bester Film. Mit Vaterfreuden kam im Februar 2014 Matthias' dritter Spielfilm in die deutschen Kinos, den rund zwei Millionen Zuschauer verfolgten. Im Herbst 2014 drehte er seine vierte Eigenproduktion Der Nanny, welche am 26. März 2015 in den deutschen Kinos anlief. Im Februar 2016 startete die Filmkomödie Der geilste Tag in den deutschen Kinos, in dem er den todkranken Andi verkörpert, der gemeinsam mit Benno (Florian David Fitz), seinen älteren Zimmernachbarn im Hospiz, einen Road Trip nach Südafrika beginnt, um den „geilsten Tag" seines Lebens zu verbringen. Sein Spielpartner Florian führte bei der Produktion die Regie und schrieb das Drehbuch, Matthias fungierte als Produzent.
Ferner wirkte er in verschiedenen Musikvideos mit, etwa in Silbermonds Ich bereue nichts (2009), Philipp Poisels Eiserner Steg (2011) oder Six60s Forever (2014).
Matthias Schweighöfer betätigt sich auch als Synchronsprecher. So lieh er in dem belgischen Animationsfilm Sammys Abenteuer – Die Suche nach der geheimen Passage (2010) der Titelschildkröte Sammy seine Stimme. In Til Schweigers Keinohrhase und Zweiohrküken sprach er den Fuchs. 2014 synchronisierte er in Das magische Haus die Stimme des Katers Thunder. In dem belgisch-französischen Computeranimationsfilm Robinson Crusoe (2016) gab er dem titelgebenden Seemann seine Stimme.
Im Februar 2016 wurde bekannt, dass Matthias an der ersten deutschen Serie des Streaming-Dienst Amazon.com beteiligt sein wird. Unter dem Titel You Are Wanted wurde die erste Staffel der Thriller-Serie, bei der Matthias auch Regie führt, im März 2017 ausgestrahlt. Matthias spielt einen Hotelmanager, der Opfer eines mysteriösen Hacker-Angriffs wird und dessen Leben dadurch aus der Bahn geworfen wird. Ebenfalls zu sehen sind Karoline Herfurth, Tom Beck und Katrin Bauerfeind.
2014 veröffentlichte Matthias seine erste Single Fliegen, die den Soundtrack zu seinem Film Der Nanny bildete. Die Single platzierte sich auf Platz 58 der Deutschen Single Charts.
Im Februar 2017 erschien sein erstes Studioalbum „Lachen Weinen Tanzen". Verantwortlich für die Produktion ist das Musiklabel PantaSounds, ein Tochterunternehmen der Pantaleon Entertainment AG.
Am 3. Dezember 2016 sang Matthias in der ZDF-Sendung Ein Herz für Kinder sein Lied Durch den Sturm. Es war sein erster öffentlicher Auftritt als Sänger.
Im Tempodrom von Berlin gab Matthias am 18. Februar 2017 sein erstes Konzert. Am 3. März gab er über Facebook weitere Konzerttermine für 2017 von Juni bis Dezember bekannt.
Matthias gründete 2009 das Modelabel German Garment mit Joko Winterscheidt, Modedesigner Kilian Kerner und Musikproduzent Sebastian Radlmeier.
Seit 2012 steht ein Wachsabbild von Matthias Schweighöfer im Wachsfigurenkabinett von Madame Tussauds in Berlin.
Matthias Schweighöfer wurde 2014 Markenbotschafter zur Einführung des neuen Krombacher Hell.
Seit Mai 2016 macht Matthias Werbung für den Amazon Fire TV Stick, ab September 2016 zusammen mit Katrin Bauerfeind.