7.Enzyme tái bản

1. DNA polymerase

Đây là enzyme chủ yếu của sự tái bản, chịu trách nhiệm tổng hợp hai chuỗi DNA ở chạc tái bản. Có ba loại DNA polymerase khác nhau, được ký hiệu là I, II và II. Cơ chế và vai trò của các enzyme DNA polymerase cũng rất khác nhau.

1.1. DNA polymerase I

Nhiệm vụ chính của DNA polymerase I là xúc tác cho quá trình lắp ráp các dNTP từng cái một vào đầu 3’ tự do của đoạn mồi đang gắn trên DNA khuôn mẫu. Kết quả là sợi DNA mới sẽ dài dần về phía đầu 3’

DNA polymerase I của E. coli còn có hoạt tính exonuclease 3’5’ xúc tác cho sự thoái hóa bậc thang từ đầu 3’ của cả DNA sợi đôi và sợi đơn khi không có dNTPs. Trong trường hợp có dNTPs, hoạt tính exonuclease trên sợi đôi sẽ bị ức chế bởi hoạt tính polymerase. Trong quá trình tổng hợp DNA, hoạt tính exonuclease thực hiện chức năng đọc sửa bằng cách cắt bỏ những nucleotide lắp ráp sai.

Ngoài ra, enzyme này còn có hoạt tính exonulease 5’3’ xúc tác cho sự chuyển chỗ của các nucleotide từ đầu 5’ của điểm đứt và bổ sung tức thời các nucleotide từ đầu 3’ tạo ra chuyển động của điểm đứt dọc theo DNA.

1.2. DNA polymerase II và DNA polymerase III

Khởi đầu, enzyme DNA polymerase I giữ vai trò chủ yếu trực tiếp trong tái bản DNA. Nhưng sau đó, người ta quan sát thấy ở E. coli đột biến không có DNA polymerase I mà vẫn có sự tái bản, và phát hiện rằng chính DNA polymerase III giữ vai trò tái bản DNA. DNA polymerase III mới là enzyme thực sự điều khiển tổng hợp DNA. Trong khi đó DNA polymerase I chỉ có vai trò loại bỏ RNA mồi nhờ cắt đầu 5’3’ và thay vào chỗ RNA mồi bằng DNA khác, còn DNA polymerase II chưa rõ tác dụng, có lẽ nó tham gia vào quá trình sửa chữa hoặc thay thế DNA polymerase I khi có khó khăn trong tổng hợp DNA.

2. Các topoisomer và DNA topoisomerase

2.1. Topoisomer

Giả sử có hai phân tử DNA mạch vòng có cùng trình tự nucleotide. Nhưng hai phân tử này có thể có số vòng (linking number-Lk) khác nhau trong phân tử. Số vòng ở đây được định nghĩa là số lần của một chuỗi DNA quấn xung quanh một chuỗi khác. Những trường hợp này được gọi là topoisomer. Topoisomer có các dạng sau:

2.1.1. Dạng lỏng lẻo (relaxed DNA)

Ở dạng này sức căng của xoắn kép là tối thiểu. Đó là dạng cấu trúc ổn định nhất của phân tử

2.1.2. Dạng siêu xoắn (supercoiled DNA)

Trục của xoắn kép có thể cuộn xung quanh mình tạo thành một siêu xoắn. Có hai dạng siêu xoắn sau:

- Siêu xoắn dương (+). Số vòng tăng, xoắn kép xoắn cùng chiều (xoắn phải) tạo thành dạng siêu xoắn dương (positive supercoil).

- Siêu xoắn âm (). Số vòng giảm, xoắn kép xoắn theo chiều ngược lại (chiều trái) tạo thành dạng siêu xoắn âm (negative supercoil),

Phần lớn những phân tử DNA trong tự nhiên ở dạng siêu xoắn âm.

2.2. DNA topoisomerase

Enzyme DNA topoisomerase (là một enzyme nuclease thuận nghịch) có tác dụng thay đổi số Lk của DNA.

2.2.1. DNA topoisomerase I

tồn tại ở cả prokaryote lẫn eukaryote và có tác dụng sau:

- Cắt một chuỗi DNA và tháo một vòng xoắn sau vị trí cắt.

- Nối lại chuỗi DNA đã bị cắt bởi liên kết phosphodiester mới. DNA sau khi được tái tạo lại có cấu trúc lỏng lẻo hơn (Hình 4.14).

2.2.2. DNA topoisomerase II

Ở prokaryote, DNA topoisomerase II có tên là DNA gyrase. DNA topoisomerase II có tác dụng cắt tạm thời hai chuỗi của DNA, có tác dụng sắp xếp lại siêu xoắn, tạo ra siêu xoắn trái () của chuỗi DNA xoắn kép .Phản ứng này cần 1 ATP.

Ở eukaryote, DNA topoisomerase II cũng được tìm thấy nhưng ít được nghiên cứu

3. Helicase và protein SSB

3.1. Helicase

Enzyme helicase (còn có tên là enzyme deroulase) có nhiệm vụ giúp chuỗi DNA từ dạng siêu xoắn sang dạng dãn thành hai sợi đơn bằng cách cắt các liên kết hydrogen giữa những base bổ sung. Dạng cấu trúc này cần thiết cho các đoạn trên chuỗi DNA mà ở đó có nhu cầu sinh tổng hợp. Phản ứng này cần sự có mặt của ATP (Hình 4.16).

3.2. Protein SSB

Các protein SSB liên kết phối hợp với DNA sợi đơn nhưng không liên kết với DNA sợi đôi. Chúng được xem như là các chất phản ứng trong tạo dòng phân tử xuất phát từ chỗ chúng có khả năng phá vỡ sự ổn định của các cấu trúc thứ cấp bên trong sợi nucleotide; tăng nhanh sự tái ủ của các polynucleotide bổ trợ và tăng hoạt tính của các DNA polymerase bằng cách loại bỏ các cấu trúc thứ cấp bên trong sợi là những yếu tố ngăn cản sự tiến triển của các enzyme này (Hình 4.17). Nhờ tính chất này, các protein SSB trở thành các chất phản ứng hữu ích trong xác định trình tự DNA.

4. DNA ligase

Có nhiệm vụ nối hai đầu 3’-OH và 5’-PO4 của hai đoạn DNA rời thành một đoạn liên tục. Một mối hàn như vậy cần một năng lượng là 2ATP (đối với eukaryote) hoặc NAD+ (đối với vi khuẩn).

Đặc điểm của DNA ligase là không làm việc với các sợi DNA đơn (single strand) mà chỉ hàn nối các đoạn DNA ở dạng chuỗi xoắn kép. Khi nối DNA, có thể gặp 2 trường hợp: đầu so le-đầu dính (protruding ends-cohesive ends) hoặc đầu bằng (blunt ends). Trường hợp đầu so le, các nucleotide nằm trên phần so le của hai đoạn DNA phải tương đồng thì DNA polymerase mới hoạt động được.